手术室太干燥，会造成细菌增多、病人伤口不宜愈合的问题;手术室湿气太重，又会给某些细菌提供迅速繁殖的条件。手术室气温太高或太低，病人和医护人员都会感到不舒服。因此，层流净化手术室使用过程中须注意按照季节、地域等调节温湿度，营造舒适的温湿环境。
据资料介绍:相对湿度低于50%，可能产生静电火花;湿度过高，超过60%以上时，空气培养即可出现真菌生长繁殖，因此，湿度控制在50%～60%之间。我国大部分地区属于温带季风区，冬季干冷，夏季湿热，冬季因空调影响，需要适当加湿，但也要因时制宜，比如长江中下游地区，先是梅雨，后是伏旱，温湿度便要因时调节。
手术室内空气的温度也有特殊要求，因为冬季医生不宜多空衣服，而病人手术部位要暴露出来，手术室内温度应比一般房间温度高些，而夏季室温过高又会引起医生和病人出汗，不利于手术部位的卫生和手术的顺利进行，气温过高甚至会引起病人和医生中暑，所以夏季手术室内温度又应比舒适性空调房间温度低些。
空气的相对温湿度过大过小都会给病人和医生带来不舒适感，相对湿度大还容易给某些细菌提供迅速繁殖的条件并带来其它危害。因此，根据国外资料统计，手术室内应保持的空气温度:冬季为24～26℃，夏季23～26℃;全年的相对湿度为55%～60%。
为了保证层流净化手术室恒温恒湿，急诊手术间的送风系统应24小时维持在低速运行状态，其他手术间可根据实际情况，在手术前1小时将层流打开维持低速运行状态，手术前30～40分钟调至高速运行。对长时间没有使用的手术间，启用时应首先清洁送风口滤网，并至少提前3小时开机运行，以达到手术室空气温湿度和洁净度要求。
对于更高标准的百级、千级超净化层流手术室来说，对温湿度的精确性要求更高，尤其要注意净化设备的检修和维护，一旦发现问题，要及时和净化公司联系，妥善维修。